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Resumen
La formación ósea (osteogénesis) es un proceso complejo en el que la diferenciación celular y la generación de una matriz orgánica mineralizada se sincronizan para producir una arquitectura jerárquica híbrida. Para estudiar los mecanismos de la osteogénesis en la salud y la enfermedad, existe una gran necesidad de sistemas funcionales que incluyan en paralelo los procesos de formación tanto celular como de matriz. Los organoides basados en células madre son prometedores como modelos 3D in vitro funcionales y autoorganizados para estudiar la fisiología y la patología de diversos tejidos. Sin embargo, para el hueso humano, aún no se dispone de un sistema de modelo funcional de este tipo. Este estudio informa sobre la diferenciación in vitro de células estromales de médula ósea humana en un cocultivo 3D autoorganizado funcional de osteoblastos y osteocitos, creando un organoide para la formación de hueso (hueso tejido) en etapa temprana. Demuestra la formación de un organoide en el que los osteocitos se incrustan en la matriz de colágeno que producen los osteoblastos y se mineraliza bajo control biológico. Al igual que en los osteocitos in vivo, los osteocitos incrustados muestran formación de redes y comunicación a través de la expresión de esclerostina.
Introducción
Los organoides se han definido como «agrupaciones celulares 3D in vitro derivadas exclusivamente de células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas o tejido primario, capaces de autorrenovarse y autoorganizarse, y que exhiben una funcionalidad orgánica similar a la del tejido de origen». Dado que el desarrollo de los organoides se basa en su naturaleza de autoorganización, a menudo también muestran variabilidad en sus resultados. Sin embargo, actualmente los organoides son los sistemas modelo in vitro que más se asemejan a la situación in vivo en los tejidos y brindan un enfoque prometedor hacia la medicina personalizada. Sin embargo, para el hueso humano, todavía no se dispone de un organoide funcional de este tipo.
Un desafío crucial aquí es la realización de un sistema 3D con diferentes tipos de células óseas que interactúan. En particular, la diferenciación de las células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea humana (hBMSC) en osteocitos, que forman el 90-95% de la fracción celular del tejido óseo, aún no se ha logrado in vitro y actualmente sigue siendo un paso crítico . en la ingeniería de modelos óseos humanos in vitro.
In vivo, los osteocitos se forman a través de la diferenciación de los osteoblastos, luego de que estos se incrustan en la matriz extracelular que producen. Los osteocitos son responsables de detectar las demandas biofísicas impuestas al tejido y de orquestar las acciones concomitantes de los osteoblastos y los osteoclastos en la remodelación del hueso, así como de mantener la homeostasis del calcio y el fosfato. Durante la diferenciación de osteoblastos a osteocitos, las células desarrollan largas extensiones llamadas procesos, mediante los cuales forman una red sensorial que traduce señales mecánicas en señales bioquímicas y a través de las cuales interactúan con otras células.
In vitro, aún no se ha demostrado que las líneas celulares basadas en osteoblastos desarrolladas como modelos de osteocitos o diferenciación de osteocitos produzcan una matriz de colágeno mineralizado completamente desarrollada y, por lo tanto, su función como modelos 3D para la formación ósea está limitada. Hasta ahora, la diferenciación completa de células madre mesenquimales (MSC) en osteocitos funcionales se ha demostrado en células de ratón, y se ha mantenido en cultivo durante un año , pero esto aún no se ha demostrado en células humanas. Recientemente, se han obtenido células similares a preosteocitos a partir de células primarias humanas y se han generado cocultivos a partir de poblaciones preparadas previamente de osteoblastos y osteocitos. Han demostrado la producción de la proteína podoplanina, un marcador para la incrustación de osteocitos en una matriz mineralizante, durante períodos de tiempo más prolongados, pero la demostración directa de la producción in vitro de una matriz mineralizada similar a un hueso en 3D que muestra la mineralización intrafibrilar bajo el control biológico aún no ha sido demostrado. También falta una demostración de la producción de esclerostina por los osteocitos a nivel de proteína, donde la esclerostina es una molécula antianabólica clave que interactúa con los osteoblastos para regular negativamente la formación de ECM. Por lo tanto, la creación de un organoide, como modelo para el desarrollo óseo, a través de la diferenciación completa de las células primarias humanas en una red funcional de osteocitos dentro de una matriz mineralizada similar al hueso, sigue siendo un desafío pendiente.
Como parte de nuestros esfuerzos para realizar un modelo óseo in vitro totalmente funcional, este trabajo informa la diferenciación de BMSC humanas en un cocultivo 3D autoorganizado funcional de osteoblastos y osteocitos, creando un organoide para la formación de hueso en etapa temprana (hueso tejido) . Usamos una combinación de inmunohistoquímica, microscopía electrónica 2D y 3D y espectroscopía para demostrar que los osteocitos forman una red que muestra la comunicación célula-célula a través de la expresión de esclerostina, incrustada dentro de la matriz de colágeno formada por los osteoblastos y mineralizada bajo control biológico.
Con esta extensa caracterización, demostramos que este es el primer sistema de modelo in vitro vivo en 3D completamente funcional para investigar los procesos de diferenciación y desarrollo de matriz durante la formación ósea temprana.
